Uji Karbohidrat

Karbohidrat merupakan suatu polihidroksi aldehid atau polihidroksi keton dan meliputi kondensat polimer-polimernya yang terbentuk. Karbohidrat memiliki rumus empiris CnH2nOn¬. Karbohidrat banyak terdapat dalam bahan nabati, baik berupa gula sederhana ataupun karbohidrat dengn berat molekul yang tinggi. Karbohidrat merupakan sumber kalori yang utama bagi mahluk hidup.

Secara alami, terdapat tiga bentuk karbohidrat yang terpenting, yaitu monosakarida, oligosakarida (terdiri atas 2-10 unit monoskarida), dan polisakarida (terdiri lebih dari 10 unit monosakarida). Contoh monosakarida adalah glukosa. Contoh oligosakarida adalah sukrosa. Contoh polisakarida adalah pati, amilum, selulosa, pektin, gum. Karbohidrat sebagai polihidroksi aldehid atau polihidroksi keton mempunyai kemampuan untuk mereduksi suatu senyawa. Sifat reduktif ini terdapat pada gugus hidroksil atom C nomor 1 untuk aldosa dan pada atom C nomor 2 untuk ketosa

Ada banyak cara yang dapat digunakan untuk menentukan kandungan karbohidrat dalam bahan pangan, misalnya dengan cara kimiawi, fisik, enzimatis, biokimia, maupun kromatografi. Penentuan kandungan karbohidrat dengan cara kimia didasarkan pada reaksi oksidasi cupri menjadi cupro. Metode penetapan secara kimia meliputi: luff schoorl , munson-walker, lane eynon , nelson-somogy , Oksidasi ferri ,Iodometri (Sukatiningsih, 2010). Analisa karbohidrat dapat dilakukan terhadap kandungan total karbohidrat, kandungan total gula, kandungan pati, serat kasar, serat pangan, dan senyawa pektin. Semua senyawa karbohidrat tersebut dapat menentukan nilai gizi pangan bahan sumber karbohidrat.

PENETAPAN PATI KARBOHIDRAT
Pati merupakan molekul polisakarida yang terdiri dari amilosa dan amilopektin dimana kedua unsure penyusun pati ini merupakan rantai dari molekul glukosa dan apabila dihidrolisa menghasilkan glukosa dan amilosa. Dengan larutan iodium amilosa akan berwarna biru, sedangkan amilopektin akan berwarna violet. Pada umumnya pati tidak terdapat dalam keadaan murni, tetapi tercampur dengan zat-zat lain. Oleh karenanya didalam analisa kimia kadar pati, zat-zat lain itu harus dipisahkan agar analisanya sempurna. Pinsip analisanya yaitu hidrolisa pati oleh asam atau enzim sehingga diperoleh kadar pati. Kadar pati dalam sample sama dengan 0,9 kali kadar gula reduksi dalam sample (Fardiaz, 1989).
Pada praktikum kali ini dilakukan analia penetapan pati dengan menggunakan metode Nelson-Somogi. Prinsip kerja metode Nelson-Somogi yaitu tereduksinya jumlah endapan kuprooksida yang bereaksi dengan arsenomolibdat yang tereduksi menjadi molybdine blue dan warna biru diukur absorbansinya. Reagen Nelson berfungsi sebagai oksidator antara kuprooksida yang bereaksi dengan gula reduksi membentuk endapan merah bata.

Pada penentuan kadar pati terlebih dahulu dilakukan perparasi sample, hal ini dimaksudkan untuk mendapatkan sample yang benar-benar murni. Perlakuan pertama adalah dengan mengambil 2 gram sample (kentang) lalu ditambahkan aquadest untuk melarutkan sample. Lalu distirer selama 1 jam yang berfungsi untuk menghomogenkan larutan dan memisahkan larutan dari komponen selain karbohidrat. Kemudian disaring dan diambil filtratnya atau padatannya dan dicuci dengan aquadest untuk mempermudah ekstraksi pati dari bahan. Residu yang dihasilkan dicuci dengan eter untuk menghilangkan lipida dan klorofil yang terkandung dalam bahan. Setelah itu residu dicuci lagi dengan etanol 10% untuk melarutkan lemak yang masih terkandung dalam sample dan untuk mencegah terjadinya hidrolisa gula oleh enzim. Hasil residu yang diperoleh kemudian dipindahkan secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam Erlenmeyer, setelah itu dicuci dengan aquadest dan ditambahkan 25% HCl untuk menghidrolisa pati dan memecah residu menjadi amilosa dan amilopektin. Lalu panaskan pada pemanas balik yang berfungsi untuk menghidrolisa pati sehingga volumenya tetap selama 2,5 jam. Setelah itu didinginkan, kemudian dinetralkan dengan NaOH 45% pada pH 7 untuk mengembalikan pH larutan akibat pengaruh asam pada hidrolisa pati. Hasil yang diperoleh kemudian diencerkan hingga volume 500 ml, lalu disaring dan diambil filtratnya sebagai sampel.
Filtrate sample dimasukkan ke dalam tabung dengan junlah yang berbeda-beda (25µl, 50µl dan 75µl) serta blanko yang berisi aquadest, ditambahkan reagen Nelson, setelah itu dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit. Reagen Nelson berfungsi sebagai katalisator yang mereduksi kuprioksida menjadi koprooksida karena adanya gula reduksi yang berwarna merah bata. Jumlah endapan kuprooksida eqivalen dengan julah gula reduksi yang ada. Kemudian larutan ditambahkan Arsenomolybdat yang akan bereaksi dengan kuprooksida membentuk molybdine pada panjang gelombang 540 nm yang dapat menyerap optimum.

GULA REDUKSI
Gula reduksi adalah monosakarida yang mempunyai kemampuan untuk mereduksi suatu senyawa. Sifat pereduksi dari suatu gula ditentukan oleh ada tidaknya gugus hidroksil bebas yang reaktif. Prinsip analisanya berdasarkan pada monosakarida yang memiliki kemampuan untuk mereduksi suatu senyawa. Adanya polimerisasi monosakarida mempengaruhi sifat mereduksinya (Baedhowie, 1982).
Pada praktikum kali ini dilakukan penetapan karboohidrat melalui penetapan kadar gula reduksi dengan metode… Penentuan gula reduksi dengan metode Luff-Schoorl ditentukan bukan kuprooksidanya yang mengendap tetapi dengan menentukan kuprooksida dalam larutan sebelum direaksikan dengan gula reduksi sesudah reaksi dengan sample gula reduksi yang dititrasi dengan Na-Thiosulfat. Selisihnya merupaka kadar gula reduksi. Reaksi yang terjadi selama penentuan karbohidrat dengan cara Luff-Schoorl adalah mula-mula kuprooksida yang ada dalam reagen akan membebaskan Iod dari garam KI. Banyaknya iod dapat diketahui dengan titrasi menggunakan Na-Thiosulfat. Untuk mengetahui bahwa titrasi sudah cukup maka diperlukan indicator amilum. Apabila larutan berubah warna dari biru menjadi putih berarti titrasi sudah selesai. Selisih banyaknya titrasi blanko dan sample dan setelah disesuaikan dengan tabel yang menggambarkan hubungan banyaknya Na-Thiosulfat dengan banyaknya gula reduksi (Sudarmadji, 2000).
Reaksi yang terjadi adalah :
R – COOH + CuO Cu2O + R – COOH
Cu2O + arsennomolybdat molybdine blue
Untuk menentukan kadar gula reduksi, pertama- tama ilakukan preparasi sample. Sebelum dianalisa bahan dipisahkan atau dikupas terlebih dahulu untuk membebaskan bahan dari zat pencampur. Pertama-tama diambil 1 gr sampel dan dimasukkan ke dalam beaker glass. Kemudian tambahkan aquades sebanyak 75 ml untuk melarutkan bahan dan untuk mempermudah ekstraksi gula reduksi dan stirer selama 15’ agar larutan benar-benar tercampur dan homogen. Tambahkan 1 gr CaCO3 agar selama penghilangan zat-zat pencampur tidak terjadi inversi dan hidrolisa dari sukrosa oleh asam-asam organik yang ada dalam bahan. Kemudian panaskan selama 30’ untuk melarutkan asam-asam organik yang terdapat dalam sampel dan juga mempercepat terjadinya reaksi. Dinginkan dan saring sehingga diperoleh filtrat. Tambahkan BaOH untuk memisahkan endapan dan cairan dan ZnSO4 untuk menjernihkan.kemudian saring dan tera sebanyak 100 ml sampai diperoleh filtrate sampel. Beberapa perlakuan dalam penetapan gula reduksi berdasarkan metode ini adalah dengan menyiapkan 3 tabung dengan jumlah volume sampel yang berbeda-beda. Ambil masing-masing (25µl, 50µl dan 75µl) dan tambahkan 1 ml Nelson (25 A + 1B) yang berfungsi sebagai oksidator yang dapat mengalami reduksi dari kuprioksida dengan gula reduksi menjadi kuprooksida yang terbentuk ekuivalen dengan banyaknya gula reduksi yan ada dan panaskan selama 20’. Pemenasan berfungsi untuk mempercepat terjadinya reaksi. Setelah itu dinginkan dan tambahkan 1 ml arsennomolybdat dan aquades hingga 10 ml. Hasil reaksi dengan Arsennomolybdat akan mengalami reaksi menjadi molybdine blue yang membentuk senyawa kompleks warna biru. Tambahkan aquades untuk melarutkan sampel. Kemudian vortex dan absorbansi pada panjang gelombang 540 nm yang merupakan panjang gelombang optimum sampel tersebut. Selain itu juga dibuat kurva standart yaitu dengan cara menggunakan larutan glukosa standart dengan volime pengambilan 0 – 900 µl, kemudian ditambah dengan 1 ml reagen Nelson lalu dipanaskan selama 20 menit. Setelah dingin, kemudian ditambah denga arsenomolybdat sebanyak 1 ml dan ditambah dengan aquadest hingga 10 ml. Kemudian divortex dan diukur absorbansinya pada panjang 540 nm. Kurva standart yang diperoleh mempunyai tujuan yaitu untuk mengetahui besarnya konsentrasi sample dengan mudah. Kurva standart yang diperoleh merupakan hubungan antara nilai absorbansi larutan glukosa sebagai sumbu Y dan volume dalam mg glukosa sebagai sumbu X. Selanjutnya diperoleh persamaan linier sebagai persamaan kurva standart yang dapat digunakan untuk menentukan kadar gula reduksi dan kadar pati.

Kimia Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif

Kimia analisis dapat dibagi dalam dua bidang yang disebut analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kulitatif membahas identifikasi zat-zat. Urusannya adalah unsure atau senyawa apa yang terdapat dalam suatu sampel (contoh). Analisi kuantitatif berurusan dengan penetapan banyaknya suatu zat tertentu yang ada dalam sampel. Zat yang ditetapkan, yang sering dirujuk sebagai kontituen yang diinginkan atau analit, dapat merupakan sebagian kecil atau sebagian besar dari contoh yang dianalisis. Jika analisis itu merupakan lebih dari sekitar 1% dari sample, maka analisis itu dianggap sebagai konstituen utama (major0. dianggap sebagai konstituen kecil (minor), jika banyaknya antara 0,01-1% dari sample. Akhirnya, suatu zat yang hadirnya kurang dari 0,01% dianggap sebagai konstituen runutan (trace).

Pengelompokan analisis kuantitatif lain dapat didasarkan pada ukuran contoh yang tersedia untuk analisis. Subdivisi itu tidak tajam benar, melainkan tumpang tindih secara tak terasa, dan kasarnya adalah sebagai berikut: bila tersedia sampel (contoh) seberat lebih dari 0,1 g, analisis itu disebut makro; analisis semi mikro dilakukan terhadap sample yang beratnya antara 10-100 mg; analisis mikro dilakukan terhadap sample yang beratnya 1-10 mg; dan analisis ultramikro melibatkan sampel pada orde 1 mikrogram (1 mg = 10^-6 g).

Hal yang biasa dilakukan sebelum melakukan analisis kimia antara lain:

1.      pengambilan atau pencuplikan sample (sampling), yakni memilih suatu sample yang mewakili dari bahan yang akan dianalisis

2.      mengubah analitnya menjadi suatu bentuk yang sesusi untuk pengukuran

3.      pengukuran

4.      perhitungan dan penafsiran pengukuran.

(Day dan Underwood,1986).

Umumnya metode modern untuk menentukan konsentrasi suatu senyawa tertentu secara kuantitatif dilakukan dengan cara kalorimetri atau spektrofotometri. Berbagai metode umumnya yang telah dikenal seperti pengukuran gula reduksi dengan metode Nelson-Somogy atau DNS (Dinitro salisilat asam) dan pengukuran protein dengan metode Biuret, Coomassie Blue, Follin-Ciocalteu dan lowry.

Pemilihan metode tergantung pada pereaksi yang tersedia, macam sample dan sensitifitas yang diinginkan. Hal yang perlu diperhatikan adalah metode yang dipilih harus cepat, mudah digunakan dan dapat untuk analisis sample pada waktu yang sama.

            Metode Biouret pada analisa protein didasarkan pada kenyataan bahwa senyawa yang berisi dua atau lebih ikatan peptida akan memberikan warna biru ungu yang karakteristik bila direaksikan dengan larutan kupri sulfat dalam alkali. Metode ini cukup baik untuk penentuan protein secara kuantitatif tapi memerlukan jumlah protein yang relatif besar dalam kisaran 1-20 mg.

            Sedangkan metode Coomassie Blue digunakan secara luas untuk penentuan protein secara kuantitatif dengan menggunakan pereaksi Coomassie Blue. Analisisnya sangat cepat, tepat, mudah digunakan dan bebas dari bahan kimia lainnya. Metode Coomassie Blue dapat digunakan untuk analisis berbagai sampel protein dan mempunyai kisaran sensitifitas 10-20 mg protein.

Pada metode ini selanjutnya dilakukan pembuatan kurva standar atau kurva kalibrasi dari dari dua metode analisis protein tersebut. Konsentrasi sampel dengan mudah diperoleh berdasarkan kurva standar dan kurva stadar tersebut harus dibuat pada setiap kali melakukan analisis, yaitu bersamaan dengan analisis sampel. Waktu analisis yang berbeda akan menghasilkan pembacaan absorbansi yang berbeda sehingga kurva standar yang diperoleh juga akan berbeda.

            Dalam analisis kimia, dari hasil yang diperoleh sering kali dihadapkan kepada masalah yang menyangkut limit deteksi, terutama bila konsentrasi suatu senyawa dalam sampel terlalu kecil dan untuk meyakinkan bahwa data pengukuran sampel yang diperoleh berbeda dengan data pengukuran blanko maka perlu ditentukan besar limit deteksi.

Limit deteksi adalah konsentrasi terendah yang dapat ditentukan berbeda sangat nyata secara statistik dari pengukuran blanko. Limit deteksi dihitung dari data pengukuran yang diperoleh pada kurva standar.